服务介绍：

免疫荧光三标即利用酪胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification）即TSA技术，在同一张切片上对三种蛋白同时进行标记，从而可实现对多种蛋白空间定位，定性及半定量分析。

TSA技术主要原理为荧光标记的酪胺在二抗上偶联的HRP与H₂O₂的作用下变为活化的酪胺并附着在靶标周围的蛋白酪氨酸残基上，此结合是共价结合。而一抗与靶标、二抗与一抗之间是非共价结合。通过抗体洗脱液处理，非共价结合的一抗二抗被洗脱掉，而共价结合的荧光酪胺依然附着在靶标周围，将靶标通过荧光标记显示出来。在检测第二个靶标时，相当于全新的一轮标记，无需考虑第二轮的抗体是否与第一轮的抗体产生交叉反应。只需改变不同种类荧光染料标记TSA即可实现多个靶标的标记。通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现双重或多重荧光染色。

主要用途：

免疫荧光染色及成像分析是研究组织形态和组织原位抗原表达不可或缺的检测技术，广泛应用于临床病理和医学及生物学研究的各个领域。凡是可以作为抗原或半抗原的物质，如：蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、酶、激素、病原体及受体等，都可以在细胞、亚细胞水平检测到。

检测原理：

免疫荧光技术根据抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体（或抗原）标记上荧光基团，再利用这种荧光抗体（或抗原）作为探针来检测固定细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在荧光显微镜下观察，当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光照射后，会发射出一定波长的荧光，从而确定靶抗原（或抗体）的性质与定位，还可利用定量技术（如：流式细胞仪）测定含量。

实验流程：

脱蜡与水化-抗原修复-血清封闭-孵育一抗-孵育二抗-DAPI染核-封片-显微镜镜检。

样本要求及运输条件：

1、提供固定合格的样本。组织离体后，选择合适的固定液立即固定，固定液的量建议大于组织体积的10-15倍，新鲜标本用合适的容器固定24-48h，大标本固定12h，再切开固定。标本常温（24℃左右）或冷藏（4℃）固定，切勿冷冻结冰，固定样本常温运输送样。

2、涂片和爬片必须充分固定，石蜡切片实验前需充分脱蜡。

3、提供准确的抗体信息。

注意事项：

1、客户提供的抗体，要求先做预实验，除了正式实验样本外，需客户提供预实验样本（预期高表达，蜡块和切片皆可）和阳性对照（若不能提供，可以协商由我司提供）。

2、抗体：一般指一抗（客户检测目的蛋白），需要客户提供准确的抗体名称、品牌货号，根据抗体货号可以确认抗体的应用（检测种属和检测方式）是否符合基本要求，否则存在风险，具体以预实验为准。接收抗体时，需确认抗体体积与保存温度，建议至少10μl，多余可返还。二抗由我司提供，若客户提供特殊来源的一抗（如：绵羊来源），需客户提供相应二抗。

3、预实验，通常采用3+1+1模式，即三个浓度梯度，一张阳性对照，一张空白对照。预实验确认效果后，再做正式实验，预实验我司可提供免费扫描并放置于服务器（可用网页直接浏览）。预实验结果优先由客户自行确认，并选择正式实验浓度，我司可协助推荐，但不对最终结果作保证，预实验和正式实验间隔周期不要太久，建议连续三周内完成。

4、同一个抗体用于不同种属、不同脏器，浓度都需做预实验确认（可以减少浓度梯度）。

5、正式实验的趋势我司不做保证。