服务介绍：    

免疫荧光五标即利用酪胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification）即TSA技术，在同一张切片上对五种蛋白同时进行标记，从而可实现对多种蛋白空间定位，定性及半定量分析。

TSA技术主要原理为荧光标记的酪胺在二抗上偶联的HRP与H₂O₂的作用下变为活化的酪胺并附着在靶标周围的蛋白酪氨酸残基上，此结合是共价结合。而一抗与靶标、二抗与一抗之间是非共价结合。通过抗体洗脱液处理，非共价结合的一抗二抗被洗脱掉，而共价结合的荧光酪胺依然附着在靶标周围，将靶标通过荧光标记显示出来。在检测第二个靶标时，相当于全新的一轮标记，无需考虑第二轮的抗体是否与第一轮的抗体产生交叉反应。只需改变不同种类荧光染料标记TSA即可实现多个靶标的标记。通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现双重或多重荧光染色。

主要用途：

1、原位展示及定量分析双重优势。

2、更全面的分析：药物靶点和肿瘤微环境同时分析。

3、不同靶点自由组合，多靶标共定位染色，也可拆分信号。

4、展示空间位置关系，区分不同细胞亚群。

检测原理：

在过氧化氢存在时，一些酶如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等可以催化一种酪胺的底物为一种非常活跃的短寿命中间体，在短时间内，中间体可以共价结合到周围蛋白的富电子表面形成酪胺化复合物，由于相接的蛋白（如HRP，抗体，目标抗原）都含有大量的酪氨酸结合位点，因此会富集大量信号，使信号被有效放大。

结果展示：免疫荧光五标-小鼠结肠癌

实验流程：

抗原修复：暴露样本中被掩盖的抗原表位，便于后续抗体结合 ，常用加热、酶解等方法。

灭活内源性过氧化物酶：消除样本自身过氧化物酶干扰，避免后续显色时出现非特异性染色，常用过氧化氢处理。

血清封闭：用无关血清封闭样本中非特异性结合位点，减少后续抗体非特异性结合，降低背景染色。

脱蜡至水：针对石蜡切片，通过二甲苯等脱蜡试剂去除石蜡，再经梯度乙醇复水，使样本适合后续水性试剂反应 。

孵育二抗：二抗与一抗（特异性结合抗原的抗体 ）结合，起到桥梁作用，后续可通过标记物（如荧光素、酶等 ）显色或发光，常用孵育盒 37℃孵育。

洗脱：洗去未结合的二抗等试剂，保证染色特异性，常用缓冲液冲洗。

染核：对细胞核染色，方便定位观察，如苏木精染核呈蓝色，使细胞结构更清晰。

标记荧光素（若适用）：若为免疫荧光染色，荧光素标记二抗或特定探针，激发光下发出荧光，用于荧光显微镜观察。

封片：用封片剂将样本封固在载玻片上，保护染色结果，便于长期保存和镜检，常用中性树胶等。

镜检：最后在显微镜下观察染色结果，分析抗原分布、表达等情况，用于病理诊断、科研分析等 。 不同实验目的、样本类型，流程细节（如试剂、时间、温度 ）会有调整。

严格的TSA法多色免疫荧光实验设计：

1、IHC免疫组化预实验 - 验证抗体 - 客户确认结果。

2、IF免疫荧光单标预实验（TSA法） - 验证浓度及颜色搭配调整优化 - 客户确认结果（表达丰度）。

3、IF免疫荧光多标组合测试预实验 - 标记顺序优化确认。

4、IF多标正式实验 - 小批量染色 - 客户确认结果。

5、IF多标正式实验 - 大批量染色 - 客户确认结果。

样本要求及运输条件：

1、提供固定合格的样本。组织离体后，选择合适的固定液立即固定，固定液的量建议大于组织体积的10-15倍，新鲜标本用合适的容器固定24-48h，大标本固定12h，再切开固定。标本常温（24℃左右）或冷藏（4℃）固定，切勿冷冻结冰，固定样本常温运输送样。

2、涂片和爬片必须充分固定，石蜡切片实验前需充分脱蜡。

3、提供准确的抗体信息。

注意事项：

1、客户提供的抗体，要求先做预实验，除了正式实验样本外，需客户提供预实验样本（预期高表达，蜡块和切片皆可）和阳性对照（若不能提供，可以协商由我司提供），TSA多标实验需要严格设置单标对照。

2、抗体：一般指一抗（客户检测目的蛋白），需要客户提供准确的抗体名称、品牌货号，根据抗体货号可以确认抗体的应用（检测种属和检测方式）是否符合基本要求，否则存在风险，具体以预实验为准。接收抗体时，需确认抗体体积与保存温度，建议至少10μl，多余可返还。二抗由我司提供，若客户提供特殊来源的一抗（如：绵羊来源），需客户提供相应二抗。

3、预实验，通常采用3+1+1模式，即三个浓度梯度，一张阳性对照，一张空白对照。预实验确认效果后，再做正式实验，预实验我司可提供免费扫描并放置于服务器（可用网页直接浏览）。预实验结果优先由客户自行确认，并选择正式实验浓度，我司可协助推荐，但不对最终结果作保证，预实验和正式实验间隔周期不要太久，建议连续三周内完成。

4、同一个抗体用于不同种属、不同脏器，浓度都需做预实验确认（可以减少浓度梯度）。

5、正式实验的趋势我司不做保证。