铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式，以脂质过氧化积累和氧化损伤为特征。其检测需结合形态学、生化指标、分子标志物及功能学实验，以下为系统化

的检测策略：

一、形态学观察

1.透射电镜（TEM）

检测指标：线粒体萎缩、嵴减少、膜密度增高，细胞膜完整但无典型凋亡小体。

步骤：固定（戊二醛/锇酸）→脱水包埋→超薄切片→染色观察。

优点：直观显示结构变化。

缺点：设备要求高，操作复杂。

 

 

 

 

线粒体整体体积缩小，形态皱缩   基质电子密度增高（因内容物浓缩）或出现不均匀分布。

二、脂质过氧化检测

1.丙二醛（MDA）检测

原理：硫代巴比妥酸（TBA）法，MDA与TBA生成红色复合物。

方法：分光光度计（532nm）或荧光法（Ex/Em=515/553nm）。

试剂盒：如TBARSAssayKit。

2.C11BODIPY581/591探针

原理：脂质过氧化将探针从红色（591nm）转为绿色（510nm）

方法：流式细胞术或荧光显微镜定量。

优势：实时、动态监测。

3.4-HNE检测

方法：ELISA或免疫荧光检测4-羟基壬烯酸（4-HNE）修饰蛋白。

三、谷胱甘肽系统分析

1.GSH/GSSG比值

检测：DTNB法（Ellman试剂）或荧光探针（如mBCl）。

意义：铁死亡中GSH消耗，GSSG增加，比值下降。

2.GPX4活性与表达

活性检测：NADPH消耗法（340nm吸光度下降）。

蛋白表达：Westernblot或免疫组化（GPX4抗体）。

四、铁代谢相关检测

1.细胞内铁水平

探针：PhenGreenSK（铁淬灭荧光）或Calcein-AM。

方法：流式细胞术或荧光显微镜。

其他：普鲁士蓝染色（组织样本）。

2.铁蛋白（Ferritin）与铁调蛋白

检测：Westernblot（FTL/FTH）、qPCR（IREB2、TFRCmRNA）。

五、功能学验证

1.抑制剂/诱导剂干预

抑制剂：Ferrostatin-1（1-10μM）、Liproxstatin-1（0.1-1μM）。

铁螯合剂：DFO（10-100μM）、去铁胺（DFOM）。

诱导剂：RSL3（GPX4抑制剂，0.1-1μM）、Erastin（SystemXc⁻抑制剂，10-50μM）。

验证：预处理抑制剂后观察细胞死亡缓解。

2.基因调控

敲低/过表达：shRNA/siRNA敲低GPX4、ACSL4或过表达SLC7A11。

六、分子标志物检测

1.关键蛋白表达

上调：ACSL4、TFR1、NOX1。

下调：GPX4、SLC7A11、FSP1。

方法：Westernblot、免疫荧光。

七、多组学联合分析

1.脂质组学：靶向分析PUFA-PL（如PE-AA/AdA）氧化产物。

2.转录组学：筛选差异基因（如ATF4、CHAC1）。

3.代谢组学：检测胱氨酸、谷胱甘肽代谢通路变化。

八、注意事项与对照设置

1.排除其他死亡方式：

凋亡：检测Caspase-3活化、AnnexinV/PI双染。

坏死：检测LDH释放、PI渗透性。

自噬：LC3-II/I比值、自噬抑制剂（如3-MA）。

2.对照设计：

阳性对照：RSL3/Erastin处理。

阴性对照：Ferrostatin-1联合诱导剂。

空白对照：未处理细胞。

九、实验优化与挑战

-细胞类型：不同细胞系对铁死亡敏感性差异大（如HT-1080、肝癌细胞敏感）。

-时间点：脂质过氧化通常在诱导后6-24小时达峰。

-交叉验证：至少联合3种方法（如MDA+C11BODIPY+GPX4WB）。

总结

铁死亡检测需多维度验证，结合形态、生化、分子及功能学证据，并严格设置对照以排除混杂因素。实验设计应针对研究模型优化条件，确保结果特异性与可重复性。