染色步骤

一.直接法

（1）将冷冻切片、涂片、印片或单层细胞培养物按要求进行固定，石蜡切片一般会在除蜡后经过酶消化处理，然后水化。随后，用0.01mol/L PH7.2---7.4的PBS洗涤5分钟，在冷风中风干后，将样品放入带有水的盒子中。

（2）添加稀释后的荧光抗体，37℃孵育30-60分钟或4℃过夜 (3) 用PBS 缓冲液洗涤2次，蒸馏水洗涤1次

（3）含有50%甘油的缓冲液片剂

使用荧光显微镜进行检查

（4）比对染色

①阳性控制是指将已经确认含有目标抗原的组织切片与待检标本同等处理，预期结果为阳性。

②阴性对照是指使用已知不含目标抗原的组织切片与待检样本进行相同处理，预期结果为阴性。

③进行空白对照实验，使用缺乏特异性抗体或PBS替代特异性抗体，结果应呈阴性反应。

④进行抑制实验时，将荧光抗体标记和非标记抗体或血清等量混合后，按照上述方法处理样本切片，预期的结果应为阴性（一步法）。

将待检验的切片分成两组，一组加入未标记的特异性血清，另一组加入未标记的同种正常血清，进行孵育后冲洗，随后加入标记的特异性血清（例如荧光标记的抗体）。因为加入了未标记的特异性血清后，切片上的抗原已被结合，导致染色效果不显著，呈现阴性结果；而加入同种正常血清的切片则会显示阳性反应（二步法）。

进行染色时要做好对照工作，在开始实验时要进行全面的对照，每次实验都需要进行阴性和阳性对照。

二.间接法

(1) 样本处理方式与直接方法相同。

将适量稀释后的特异性抗体滴加到样本上，放入湿盒中，在37摄氏度下孵育30至60分钟，或者在4摄氏度下过夜。

在湿盒中放入已适当稀释的间接荧光抗体，并将温度控制在37℃，处理时间为30至60分钟。

使用PBS溶液进行两次洗涤，然后用双蒸蒸馏水洗涤一次。

使用甘油缓冲液封装玻片，并在荧光显微镜下进行观察。

染色对照：可使用阴性对照和空白对照进行比较。

三.补体法

⑴标本处理与直接法相同。

⑵将适量稀释的特异性抗体和相同量的补体混合后滴加入湿盒中，在37摄氏度下孵育30分钟，然后用磷酸缓冲盐水洗涤3次。

⑶将经过适当稀释的抗补体荧光抗体滴加到培养皿中，放置在37摄氏度下30分钟。用磷酸缓冲盐水洗涤2次，再用蒸馏水洗涤1次。

⑷用甘油缓冲液封装片剂。

⑸在对照染色时，可以用正常血清替代，即经过56摄氏度30分钟的灭活处理后，将灭活的补体与特异性抗体等量混合，然后进行染色，结果应当呈阴性。

四.双重染色荧光技术

当需要直接检测同一样本中的两种抗原时，可以使用不同的荧光染料来分别标记抗体。

双重染色一步法：先混合两种不同标记的抗体，按照直接染色的步骤进行。

双染色的二步法：首先孵育一个标记抗体，无需冲洗，然后再孵育另一个标记抗体，按照间接法的步骤进行。

五.注意事项

免疫荧光法适合于冰冻切片染色，因为这种切片通常保存抗原的能力更好。若选择石蜡切片，则应优先考虑免疫酶法等染色技术。

使用荧光标记的商品抗体进行染色前，应该先确定抗体的效力，找到适合的稀释倍数后再进行成批染色。一般来说，当阳性物质呈明亮荧光而背景较暗时的稀释倍数是最适合的。高稀释倍数的荧光抗体可减少非特异性染色，使染色结果更具特异性，但若稀释倍数过高则可能导致假阴性结果的出现。

荧光抗体稀释度较低时，有利于观察结果，但可能会导致出现非特异性的染色，甚至产生假阳性结果。

除去非特异性荧光。要去除非特异性荧光有很多种方法。通常情况下，冰冻切片的非特异性荧光会更明显，而石蜡切片的非特异性荧光相对较轻。常见的处理方法包括：

①先使用非免疫血清（如10%牛血清）处理组织切片，然后进行荧光染色。

2. 通过小鼠相应组织的干粉吸收荧光抗体中的非特异性成份。

③确定适当的稀释比例和切片厚度。

选择具有高特异性和高效力的荧光抗体。

（清洗必须要彻底。每一步骤都需要使用蒸馏水或缓冲液进行清洗，以清除残留在切片中的试剂，以达到特异着色的目的。在清洗时，无论是冲洗还是振荡清洗，都应遵循基本原则，确保清洗彻底，或者说充分稀释上一步骤中的试剂，使其浓度降至最低。

只要有充足的时间，建议使用静置廷长的洗涤时间，以防止脱片，这是一个较好的方法。洗涤液的PH值应该在7.2~7.4之间，太高或太低都不利于染色过程，特别是在偏碱性的PH值条件下。

孵化时间和温度。通常最佳的时间和温度是37℃，持续20至30分钟。当然，这也与抗体的强度、组织抗原的含量和位置、切片的厚度等因素有关。