近年来，随着对外泌体的研究不断深入，外泌体作为细胞间通讯的重要工具，在多种生物学和医学领域中展现了巨大的应用潜力。外泌体是一类由细胞分泌的纳米颗粒，广泛存在于体液中，如血液、尿液、唾液等。外泌体的独特结构及其所携带的生物活性物质，如蛋白质、RNA、DNA等，使得其在肿瘤诊断、药物递送、免疫调节等方面具有重要的研究价值。

为了进一步解析外泌体的结构与功能，透射电子显微镜（TransmissionElectronMicroscopy,TEM）作为一种高分辨率的成像技术，被广泛应用于外泌体研究中。电镜染色是电镜技术中至关重要的一步，它可以增强外泌体在电镜下的对比度，帮助研究者清晰观测其超微结构。如何正确进行外泌体电镜染色？在本文中，我们将为大家详细介绍外泌体电镜染色的关键步骤与技巧。

皮诺飞生物外泌体电镜

1.外泌体样品准备

外泌体电镜染色的第一步是样品的准备。为了获得高质量的电镜图像，外泌体样品的分离和纯化是非常重要的步骤。常用的外泌体分离方法包括超速离心法、密度梯度离心法和免疫亲和捕获法等。

超速离心法：这是目前最常用的外泌体分离方法，通过多步离心逐步去除大颗粒物质，最终获得富含外泌体的上清液。

密度梯度离心法：进一步提高外泌体的纯度，将其与其他细胞碎片、蛋白质等分开。采用蔗糖或碘化铯等密度梯度介质，可以在分离过程中更好地保留外泌体的完整性。

免疫亲和捕获法：利用外泌体膜表面特异性标志物（如CD63、CD81等）进行免疫捕获，能够进一步提高外泌体的特异性，但对设备要求较高。

样品分离后，应立即进行电镜样品的制备和固定，以保证外泌体结构的稳定性。

2.固定和脱水

为了确保外泌体样品在电镜下的形态保持不变，固定步骤至关重要。一般采用化学固定剂如戊二醛（glutaraldehyde）进行固定。

固定过程：在分离出的外泌体样品中加入2.5%戊二醛溶液，并在室温下孵育15-30分钟。戊二醛能够交联外泌体膜蛋白，形成牢固的交联网状结构，从而保护外泌体的原生形态。

脱水过程：固定后的外泌体样品需要经过梯度乙醇脱水处理，常见的乙醇梯度为30%、50%、70%、90%、100%。脱水的目的是去除样品中的水分，防止样品在真空环境下发生收缩或变形。

在此过程中，需注意固定剂的浓度及孵育时间的控制，过长的固定时间可能会导致样品过度交联，影响其电镜成像质量。

3.样品上载与薄膜准备

外泌体样品的固定和脱水完成后，需要将样品转移到电镜载网（grid）上，并进行薄膜准备。电镜载网通常由铜或镍材料制成，其表面涂有一层碳或硅膜，以增强样品的附着力。

样品上载：将一小滴外泌体悬液滴加到电镜载网上，让其自然干燥。样品可以通过重力作用沉积在载网表面。

薄膜准备：为了避免样品在观察过程中受到电子束的损伤，载网表面可以加上一层厚度为几纳米的碳膜或硅膜。这层膜既可以增强样品的稳定性，又不会影响电子的穿透性。

当样品成功沉积在载网上后，即可进入下一步——染色。

4.电镜染色技术

外泌体的电镜染色主要是为了提高其在透射电镜下的成像对比度。由于外泌体本身较小且无电子密度差异，其在电镜下的成像往往对比度较低，因此需要通过重金属染色提高对比度。常用的电镜染色剂包括磷钨酸（phosphotungsticacid,PTA）和醋酸铀（uranylacetate）。

磷钨酸染色：是一种常用的负染色技术，通过在外泌体周围形成对比强烈的背景来突出外泌体的结构细节。使用1%-2%磷钨酸溶液进行染色，操作简单，成像效果较好。

醋酸铀染色：是一种较为经典的正染色技术，能够直接与外泌体的膜蛋白或脂质结合，形成高电子密度区域，从而增强外泌体的对比度。

染色步骤完成后，需将样品自然晾干，以便进行透射电镜的成像观察。

在经过电镜染色之后，外泌体样品的处理工作接近尾声。电镜成像过程中的一些细节操作以及成像质量的控制，也会对最终的研究结果产生显著影响。因此，接下来我们将继续探讨电镜成像的步骤和优化技巧，以及外泌体电镜染色应用中的一些常见问题和解决方案。

5.皮诺飞生物外泌体电镜结果展示：