皮诺飞生物 RNA 转染实验服务介绍

核心定位：将外源 RNA 分子（如 siRNA、miRNA、mRNA、sgRNA）高效导入靶细胞，实现基因沉默、基因过表达或基因编辑等目的，是研究基因功能、信号通路及药物筛选的关键技术服务，可提供从转染条件优化到转染效果验证的全流程支持。

一、技术原理与应用场景

1. 什么是 RNA 转染？

RNA 转染是借助转染试剂或物理方法，将体外合成或纯化的外源 RNA 分子导入哺乳动物细胞、昆虫细胞等靶细胞的过程。通过该技术，外源 RNA 可在细胞内发挥特定功能（如 siRNA 介导基因沉默、mRNA 直接表达蛋白），无需整合到细胞基因组，具有操作简便、作用快速、无基因组整合风险等特点。

2. 核心技术原理

根据转染试剂类型不同，主要分为两类：

• 脂质体介导转染：转染试剂（如 Lipofectamine 3000）与 RNA 形成带正电的复合物，通过与带负电的细胞膜相互作用，经内吞作用进入细胞，随后复合物解离释放 RNA；

• 聚合物介导转染：阳离子聚合物（如 PEI）与 RNA 通过静电作用结合，形成纳米级复合物，同样通过内吞作用进入细胞，避免 RNA 被核酸酶降解，提高转染效率。

3. 核心应用领域

基因沉默研究：通过 siRNA 转染，特异性下调靶基因表达，探究基因功能及对细胞表型（增殖、凋亡、分化）的影响

基因过表达研究：通过 mRNA 转染，直接在细胞内表达目的蛋白，快速观察蛋白功能（无需转录过程）

miRNA 功能研究：转染 miRNA 模拟物（mimic）或抑制剂（inhibitor），调控内源性 miRNA 水平，分析其对靶基因的调控作用

基因编辑辅助：转染 sgRNA（配合 Cas9 蛋白或 Cas9 表达质粒），实现 CRISPR/Cas9 介导的基因敲除或敲入

二、实验方法

阶段 1：前期准备与条件优化

1. 实验设计与材料准备

◦ 明确需求：确定 RNA 类型（siRNA/miRNA/mRNA）、靶细胞系（如 HeLa、HEK293T、HUVEC）、转染后检测指标（如 qPCR 检测基因表达、Western blot 检测蛋白水平）；

◦ 材料准备：

▪ RNA：确保纯度（OD260/OD280 1.8-2.1）与完整性（琼脂糖电泳无降解），siRNA 需验证序列特异性；

▪ 转染试剂：根据细胞类型选择适配试剂（如贴壁细胞选 Lipofectamine 3000，悬浮细胞选 RNAiMAX）；

▪ 细胞：处于对数生长期，转染前 24 小时接种，确保转染时细胞融合度达 50%-70%（贴壁细胞）。

1. 转染条件优化（可选）

◦ 针对不同细胞系，设置不同的 “RNA 浓度 - 转染试剂用量” 组合（如 siRNA 浓度 20-100nM，试剂用量 0.2-1μL / 孔），通过荧光标记 RNA（如 Cy3-siRNA）或报告基因 mRNA（如 GFP mRNA），筛选转染效率最高的条件。

阶段 2：RNA 转染操作

以 6 孔板贴壁细胞（HEK293T）转染 siRNA 为例：

1. 复合物制备

◦ 溶液 A：在无血清培养基（如 Opti-MEM）中加入 siRNA，轻柔混匀（例：500μL Opti-MEM + 20pmol siRNA）；

◦ 溶液 B：在无血清培养基中加入转染试剂，室温孵育 5 分钟（例：500μL Opti-MEM + 5μL Lipofectamine 3000）；

◦ 将溶液 A 与溶液 B 混合，室温孵育 15-20 分钟，形成 RNA - 转染试剂复合物（避免超过 20 分钟，防止复合物沉淀）。

1. 细胞转染

◦ 转染前，用无血清培养基洗涤靶细胞 1 次，去除原有培养基中的血清（血清可能影响转染效率）；

◦ 每孔加入 1mL RNA - 转染试剂复合物，轻轻摇晃培养板使复合物均匀分布；

◦ 37℃、5% CO₂培养箱孵育 4-6 小时后，更换为含 10% 胎牛血清的完全培养基（避免长时间无血清培养损伤细胞）。

阶段 3：转染效果验证

1. 转染效率检测（荧光法）

◦ 若转染荧光标记 RNA（如 Cy3-siRNA），转染后 24 小时用荧光显微镜观察，计数荧光阳性细胞占总细胞的比例（通常要求转染效率≥70% 为合格）；

◦ 或用流式细胞仪定量检测荧光阳性细胞比例，结果更精准。

1. 功能验证

◦ siRNA 转染验证：转染后 48-72 小时，通过 qPCR 检测靶基因 mRNA 表达水平（若沉默有效，表达量较对照组下降≥50%），或 Western blot 检测靶蛋白水平（蛋白下降趋势与 mRNA 一致）；

◦ mRNA 转染验证：转染后 6-24 小时，通过 Western blot 检测目的蛋白表达（无需等待转录，蛋白表达快速），或免疫荧光观察蛋白定位；

◦ miRNA 转染验证：转染 miRNA mimic 后，qPCR 检测内源性 miRNA 水平（需升高≥2 倍），同时检测靶基因 mRNA / 蛋白表达（若为抑制性 miRNA，靶基因表达应下降）。

阶段 4：后续实验支持（可选）

• 细胞功能检测：转染后检测细胞增殖（MTT/CCK-8）、凋亡（流式凋亡检测）、迁移（Transwell）等表型变化；

• 信号通路分析：通过 Western blot 检测通路相关蛋白（如磷酸化蛋白），探究 RNA 调控的下游机制。

三、实验结果呈现

1. 关键步骤结果

2. 最终交付成果

1. 原始数据：转染效率荧光图像、流式检测原始数据、qPCR Ct 值及相对表达量、Western blot 原始曝光图；

2. 分析报告：包含转染条件（RNA 浓度、试剂用量）、转染效率统计、靶基因 / 蛋白表达变化分析、统计学结果（如 P 值，确保差异显著）；

3. 实验建议：根据转染结果，提供后续实验优化方向（如调整 RNA 浓度、延长 / 缩短检测时间）。

3. 结果解读

• 若转染效率达标且功能验证显示靶基因 / 蛋白表达符合预期（如 siRNA 有效沉默、mRNA 有效表达），表明转染成功，可用于后续细胞功能实验；

• 若转染效率低，需调整转染条件（如增加试剂用量、优化细胞接种密度）；若功能验证未达预期，需排查 RNA 序列特异性（如 siRNA 脱靶）或检测时间（如 mRNA 表达峰值未捕捉），并重新优化实验。

（注：文档部分内容可能由 AI 生成）