皮诺飞生物质粒构建实验服务介绍

核心定位：根据客户需求设计并构建重组质粒，包括目的基因克隆、载体改造、元件组装等，是基因功能研究、蛋白表达、基因编辑等实验的基础技术服务，可提供从序列设计到质粒鉴定的全流程解决方案。

一、技术原理与应用场景

1. 什么是质粒构建？

质粒构建是将目的基因片段与载体（如克隆载体 pUC19、表达载体 pcDNA3.1、慢病毒载体 pLVX 等）通过酶切、连接等分子生物学操作，组装成可在宿主细胞（如大肠杆菌、哺乳动物细胞）中复制或表达的重组质粒的过程，核心是实现目的基因的体外扩增与功能研究。

2. 核心技术原理

• 酶切反应：使用限制性内切酶（如 EcoRⅠ、BamHⅠ）切割目的基因片段与载体，产生互补的黏性末端或平末端，为后续连接做准备；

• 连接反应：通过 DNA 连接酶（如 T4 DNA 连接酶）将酶切后的目的基因片段与载体连接，形成重组质粒；

• 转化与筛选：将重组质粒导入感受态细胞（如大肠杆菌 DH5α），通过抗性筛选（如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性）及菌落 PCR、测序验证，获得阳性克隆。

3. 核心应用领域

基因功能研究：构建过表达质粒、RNA 干扰质粒，探究目的基因对细胞表型的影响

蛋白表达制备：构建原核表达质粒（如 pET-28a）、真核表达质粒（如 pcDNA3.1），用于重组蛋白纯化

基因编辑工具构建：构建 CRISPR/Cas9 质粒、TALEN 质粒，实现特定基因的敲除或敲入

报告基因实验：构建荧光素酶报告质粒、GFP 融合质粒，用于启动子活性分析或蛋白定位研究

二、实验方法

阶段 1：前期设计与准备

1. 需求确认与序列设计

◦ 明确客户需求：包括载体类型（克隆 / 表达 / 病毒载体）、目的基因来源（cDNA / 基因组 DNA / 合成序列）、元件插入（如启动子、标签蛋白 HA/Flag/GFP、终止子）；

◦ 序列分析：通过软件（如 Vector NTI、SnapGene）分析目的基因与载体的酶切位点，避免目的基因内部含有所选酶切位点，确定最佳酶切方案（单酶切 / 双酶切）。

1. 材料准备

◦ 目的基因模板：客户提供或根据序列合成 cDNA；

◦ 载体：根据需求选择商业化载体或客户提供载体；

◦ 试剂：限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、DNA 聚合酶、琼脂糖、DNA Marker、感受态细胞、抗性培养基等。

阶段 2：目的基因获取与载体处理

1. 目的基因扩增（PCR 法）

◦ 根据目的基因序列设计特异性引物（5' 端引入与载体匹配的酶切位点及保护碱基）；

◦ 以 cDNA 或基因组 DNA 为模板，通过 PCR 扩增目的基因片段，反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化目的基因（使用胶回收试剂盒）。

1. 载体酶切与纯化

◦ 按照酶切体系（载体 DNA 1μg、限制性内切酶 1-2μL、缓冲液 2μL、无酶水补至 20μL），37℃孵育 1-2 小时；

◦ 若为双酶切，需确认两种酶的兼容缓冲液，同步或分步进行酶切；

◦ 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收线性化载体（去除环状载体，避免自连）。

1. 目的基因与载体连接

◦ 按照连接体系（目的基因片段 30-50ng、线性化载体 10ng、T4 DNA 连接酶 1μL、连接缓冲液 2μL、无酶水补至 20μL），16℃连接过夜（或 25℃连接 30 分钟，根据连接酶类型调整）。

阶段 3：转化、筛选与鉴定

1. 转化感受态细胞

◦ 取 10μL 连接产物加入 100μL 感受态细胞（如 DH5α），冰浴 30 分钟；

◦ 42℃热激 90 秒，迅速冰浴 2 分钟；

◦ 加入 800μL 无抗 LB 培养基，37℃、200rpm 振荡培养 1 小时，使细胞恢复活性并表达抗性基因。

1. 抗性筛选与菌落 PCR 鉴定

◦ 取 100μL 培养物均匀涂布于含对应抗性的 LB 琼脂平板（如氨苄青霉素抗性平板），37℃倒置培养 12-16 小时；

◦ 挑选 3-5 个单菌落，分别接种至含抗性的 LB 液体培养基，37℃振荡培养 8 小时；

◦ 以菌液为模板，用目的基因特异性引物进行菌落 PCR，电泳检测阳性菌液（出现预期大小条带即为阳性）。

1. 测序验证与质粒提取

◦ 选取 2-3 个阳性菌液送测序，验证目的基因序列正确性（无碱基突变、插入或缺失）及插入方向正确性；

◦ 对测序正确的菌液，使用质粒提取试剂盒（小提 / 中提 / 大提，根据客户需求）提取重组质粒，测定质粒浓度与纯度（Nanodrop 检测 OD260/OD280，比值 1.8-2.0 为合格）。

阶段 4：额外服务（可选）

• 质粒转染验证：将重组质粒转染至哺乳动物细胞（如 HEK293T），通过 Western blot（检测标签蛋白）或荧光显微镜（检测 GFP 等荧光标签）验证目的基因表达；

• 病毒包装：若为病毒载体（慢病毒、腺病毒），进一步进行病毒包装与滴度测定。

三、实验结果呈现

1. 关键步骤结果

2. 最终交付成果

1. 重组质粒：根据客户需求提供不同量的纯化质粒（小提 10-20μg、中提 100-200μg、大提 1mg 以上），溶于无酶水或 TE 缓冲液；

2. 实验报告：包含实验流程（酶切方案、连接条件、测序结果）、关键步骤电泳图、测序报告、质粒浓度与纯度检测数据；

3. 剩余材料：剩余阳性菌液（甘油保存，-80℃可长期存放）、未用完的引物等（若有剩余）。

3. 结果解读

• 若测序结果显示目的基因序列正确、插入方向无误，且质粒浓度与纯度达标，表明质粒构建成功，可直接用于后续实验（如细胞转染、蛋白表达）；

• 若出现序列突变或插入方向错误，将重新优化构建方案（如调整引物设计、更换酶切位点），免费进行二次构建，确保交付合格质粒。